一、實驗概述及試劑準備
細胞免疫熒光實驗通過特異性抗體與細胞內相應抗原結合，再利用熒光標記的二抗進行檢測，從而實現對細胞內蛋白的可視化。這一技術在細胞結構與
功能研究、疾病機制探索等方面具有重要應用。
1. 抗體選擇
一抗需特異性識別目標蛋白，熒光二抗則要與一抗來源動物種屬相匹配。例如，如果一抗是小鼠來源，二抗需是抗小鼠的熒光抗體。
2. 固定劑與破膜劑
4% 多聚甲醛用于固定細胞，保持細胞結構。曲拉通（破膜劑）用于通透細胞膜，使抗體能夠進入細胞內與抗原結合，但對于膜蛋白染色則可能不需要
此步驟。
3. 封閉試劑
BSA（牛血清白蛋白）或二抗來源動物的血清（如山羊血清）用于封閉非特異性結合位點，減少背景熒光。
4. 其他試劑
PBS 用于清洗細胞，DAPI 用于染細胞核，抗熒光淬滅封片劑用于封片并防止熒光淬滅，可選用含 DAPI 的封片劑簡化操作。
5.玻片選擇
-貼壁細胞：可使用蓋玻片或專用細胞爬片，還有共聚焦小皿可供選擇。不同規格的共聚焦培養皿（如圓形的 φ24mm、φ20mm、φ14mm、φ8mm）分別對應不
同孔板配套用細胞爬片。
-懸浮細胞：直接使用靶點科技懸浮細胞免疫熒光專用玻片（Biotarget）。不要再用傳統的方法，否則掉片不可避免。
二、細胞爬片準備及操作
1.爬片處理（非共聚焦小皿）
將剪裁好的爬片或購買的成品爬片，置于濃硫酸中浸泡過夜，然后用自來水沖洗干凈。接著將其置于消毒飯盒中，飯盒底面放紗布，玻片斜靠在飯盒側
壁且正面不接觸紗布，進行高壓蒸汽滅菌后烘干。
對于原代細胞或貼壁不牢的細胞，爬片前最好用多聚賴氨酸、層粘蛋白或膠原溶液處理玻片以增加細胞粘附性，處理后用培養基沖洗 1 - 3 遍再放入培
養基中。
2.共聚焦小皿
無需前處理操作，直接在超凈臺打開包裝，加入細胞懸液，蓋上皿蓋，置于培養箱中培養即可。
三、實驗操作
1.細胞接種準備
胰酶消化細胞后計數，重懸細胞于培養基中。根據玻片大小，在每個孔里放爬片的位置先滴 100ul 培養基，使玻片與培養皿靠培養基張力粘合，然后放
玻片，防止加細胞懸液時玻片漂起。
2.細胞接種
根據實驗需要及細胞生長情況選擇合適的細胞密度接入培養板內。待細胞貼壁后，可去上清加含藥培養基。
3.玻片取出
按照實驗設計，作用一定時間后取玻片（通常作用 24h）。取玻片時，可將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤，輕輕勾起爬片，用小鑷子取出。對于多時
間點實驗，取出所需數量的爬片時應用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子，未取出的可接著繼續培養。
四、固定、通透及封閉步驟
1.清洗與固定方式
可以將爬片取出用 PBS 清洗后固定，也可以直接在孔板中清洗并固定。共聚焦小皿則直接移除培養基，加入 PBS 清洗 1 - 3 次（不可劇烈搖晃），然后
加入 4% 多聚甲醛進行固定，通常在室溫（RT）固定 15 - 20min。
2.通透及封閉劑選擇與作用條件
如果抗體針對胞內蛋白，則需要通透步驟。常用的透化劑是 0.1% Triton X - 100（將 100% 的成品用 PBS 稀釋），作用 10min，但文獻中也有用 0.2% 或 0.5% Triton X - 100 的，具體可根據預實驗進行調整。
BSA 濃度為 1% 或 5%（用 PBS 溶解），血清濃度為 10%，在室溫（RT）封閉 30min。如果一抗結合力很強或二抗有非特異性結合，可添加 0.1% Tween20。
五、抗體孵育及染色封片
1.一抗稀釋與孵育條件
封閉結束后，用 PBS 清洗 3 遍，然后孵育一抗。一抗可用封閉液稀釋，也可以用 PBS 或抗體稀釋液，在 4℃孵育過夜。一抗稀釋比例可參照抗體說明書，建議從推薦比例中間開始試。
2.二抗孵育操作
次日吸走一抗（可回收）后，用 PBST 清洗 3 遍，每次 5 - 10min，然后避光孵育二抗 1h。
3.DAPI 染色操作
去除二抗，用 PBS 清洗三次，加入 DAPI，室溫靜置 5min，去除 DAPI，再用 PBS 洗 3 次。
4.封片操作
向載玻片上加入一滴封片劑，將蓋玻片緩慢扣在載玻片上，細胞所在面靠近載玻片，用吸水紙吸除多余封片劑。
免疫熒光，其實各種Protocol大同小異，核心除了多聯系，還要多思考。弄懂背后的邏輯。不能機械的做。
